中间体储存层析和沉淀法捕获步骤对抗体稳定

摘要

用ProA亲和层析和PEG沉淀法从细胞培养上清中纯化得到IgG2亚型的抗体。ProA层析法捕获的中间体储存在中性洗脱液中，PEG沉淀法得到的中间体以固体形式分别在不同的3个温度条件下（-20°5°常温）储存13个月后比较捕获技术对于产品稳定性的影响结果。在储存过程中分别测定了6个时间点单体、高分子杂质质量的损失和不同组分中电荷变异体的变化。在研究期间，样品分别经过了DSC、DSF和CD检测在储存过程中发生的结构变化。

在三个储存温度条件下，ProA纯化的抗体不论是单体含量还是质量损失方面都表现的比较稳定。在层析过程中会有短暂的酸性异构体形成，但在进行几天的储存后会变成带电体。沉淀法抗体在-20或者5℃储存3个月以后质量不会有任何的损失，但是回收率会下降到65%,在常温储存3个月后，沉淀抗体不稳定会降解。

关键词：层析法，沉淀法，稳定性，储存性，免疫球蛋白，储存

1引言

抗体制剂的保质期和稳定性已经有很广泛的研究，但是它中间体工艺可用的数据是有限的。经典的研究都是基于最后药物制剂理想的保存条件1-3，但是现在生物制药已经普及到全球范围内，原料要进行运输至中间加工的地方。年欧洲医疗机构公布了一个生物技术衍生品制造业的工序验证指南4，指南中推荐评价保存步骤，中间制造，中间体运输步骤的影响。为了确定一些对中间体干扰的不可预期的影响，他们建议在最恶劣的条件和非标准的条件下做研究。此外，中间体的特性是在进一步研发，确定步骤的设计和前期确立研究方法的关键。因此，蛋白变化和稳定性在所有工艺过程阶段都是很重要的。

稳定性的研究是很耗费时间和成本，因此样品在前期研发阶段一定要储存在各自最适合的温度和条件下以得到更好的数据。为了加速保质期的研究用阿伦纽新方程式方程推出样品在高温和低温下可能的储存时间5，为了制定保质期，一些反应蛋白降解的质量参数一定要确定。

所有的蛋白包括重组抗体都在生产储存的过程中容易改变。抗体普遍的一些变化是糖基化，去酰胺化、氧化、N端焦谷氨酰胺环化、c端赖氨酸裂解、天冬氨酸异构化和二硫键断裂等6。这些变化导致了微观高度不一致，同时可以影响抗体的功能和稳定性7。在生产和研发过程中不可能获得所有的变体，因此要用参数代替。不论是确定限制关键蛋白降解的途径还是确定合适的储存条件，如温度湿度光照都是非常重要的。研究抗体在储存过程中降解快速的办法是HPLC,最广泛使用的技术是分子筛，阳离子交换技术或者通过亲和层析组分含量分析。这些方法捕获抗体聚集体的形成，降解/剥落到较小的分子变体和电荷的形成。

现在，最主要的抗体产品是在哺乳动物细胞系中表达得到，用ProA亲和层析纯化，纯度可以达到95%8，甚至大于98%9。由于抗体在ProA上有高捕获能力，在这一步蛋白相当于得到浓缩和纯化。高浓度的抗体遇上恶劣的酸性洗脱液可以促进聚集体的形成，因此可能会造成产品的损失10。另外，ProA层析介质是比较昂贵，大大增加了整个工艺的成本，特别是在早期研发阶段没有利用到它的最大使用寿命11。因此，其他研究人员包括我们自己提出抗体捕获的替代方法，比如混合层析12，或者双水相萃取13，或者沉淀法14-16。

沉淀法是一个可行的不用层析的可以持续操作的替代方法。它只适用于补料培养抗体生产的不同滴度抗体纯化。近期Burgstaller等人提供了用PEG沉淀法过滤纯化抗体，纯度回收率都接近ProA层析法17。在PEG沉淀捕获阶段，抗体在培养上清中的溶解度是比较低的，通过加入PEG使其沉淀。

沉淀固体通过在溶解液中溶解过滤来获得，因此抗体被浓缩，宿主蛋白被大量的清除。为了满足药品纯度要求，蛋白必须至少在成药之前前一步在缓冲液中进一步的过滤/超滤处理。在本次研究中，我们比较了两种捕获抗体的技术对中间体稳定性的影响，抗体用ProA层析法和沉淀法从细胞培养上清中捕获。ProA层析法获得的抗体洗脱中和后储存在液相中，沉淀法获得的抗体固体的形式储存。样品储存在同样的条件下（-20℃5℃和RT）12个月，常规储存条件-20和5℃下的等待进一步的验证。储存在常温下的（不受控制）包括最恶劣的情况，EMA指南中推荐延长时间和更高的温度测试，来得到在制造过程中更理想的条件。在两种条件下，在储存前样品中间体没有经过任何处理步骤，一直在放置。应该指出的是高分子杂质和低分子杂质浓度的不同会使结果不一样，因为ProA法在宿主中的清除杂质更高效。沉淀法的抗体储存在沉淀条件下，即聚乙二醇浓度13.2%(w/w)。

沉淀法的以沉淀的形式储存的优点在于体积小所以储存的成本会降低。重组抗体用HPLC基于分子筛，离子交换PH梯度的方法在6个时间点（1、3、6、10、13个月）分别去测试，用DSC、DSF和CD法对储存前后的样品测试来观察结构的变化。

2材料和方法

所有的试剂耗材都是来自Sigma，另有说明的除外。

2.1抗体

实验用的抗体是来自人源化的IgG2型重组抗体，我们用的是在CHO细胞系表达的细胞上清中获得浓度为3.3g/L的抗体，抗体是在同样的CHO细胞系中用proA亲和层析法获得（2.1.1）和沉淀法（2.1.2）纯化得到。

2.1.1ProA层析法

ProA层析法是基于Mab树脂上进行（GEHealthcare,Sweden）用50mMpH7.0磷酸盐平衡,mM柠檬酸钠pH5.5洗涤。抗体用pH3.6的醋酸钠一步洗脱，在pH3.6中孵育了1h后pH调节至6.0。

2.1.2沉淀法

聚乙二醇，平均分子量D,被用于抗体沉淀之前有文献报道过14。总之，40%的PEG的固体溶解在mMTrisPH7.5缓冲液中，培养细胞的上清混合在EP管中混匀后使得PEG最终的浓度是13.2%。抗体重悬液在震荡仪上震荡10min(Cole-Parmer,USA)，r/min离心5min分离沉淀和上清。沉淀抗体有mMph7..2%PEG缓冲液洗涤(确保洗涤前后重量保持不变)，继续震荡10min，再进行rpm5min离心后细胞培养液倒出，沉淀进行储存。在分析前，抗体沉淀回收体积和之前的是相同的。mMTris-HCLPH7.5做为缓冲液，Burgstaller已经详细的介绍了实验步骤和条件17。

2.2储存条件的

在两种条件下，ProA层析法和沉淀法，样品在储存过程中没有任何额外步骤，ProA层析法的抗体中和后以液体形式储存，沉淀法得到的抗体在移除上清后以沉淀法储存。

样品采用尖底避光聚丙烯离心管储存，-20℃是在标准的实验室储存室冻存（Stockholm,Sweden)，5±3°C条件下在冰箱储存(Wiesbaden,Germany).室温条件是在我们一个室温实验室里面储存，温度在20-25℃，这种情况包括了一些极端条件就如不可预期的干扰，快速降解是预料中的。

2.3纳米差示扫描量热法

样品在Slide-A-Lyzercassettes(ThermoFisherScientific,Waltham,USA)中透析，分子量在10Da截留至20mMph6.9的磷酸盐缓冲液中，稀释浓度到3mg/ml。液体装入样品孔中（TA-Instruments(NewCastle,DE,USA)纳米DSC仪器((model:60)对照细胞在PH6.mM的磷酸钠缓冲液中保温在20℃到℃扫描速率为1℃/min.在样本运行过程中，仪器要用细胞缓冲液和水冲洗，在每次实验结束后要用0.5MNaCl0.1M乙酸清洗，1mg/ml的胃蛋白酶37℃孵育3h后用水冲洗。得到的热力图数据是用TA纳米分析软件处理分析，所有的样品要减去空白值。

2.4圆二色谱

CD仪器来自(Surrey,UK)，样品稀释到0.3g/l，在路径长度为0.1cm的细胞中测量。

光谱范围在nm到nm之间，带宽设置在1nm,信号平均超过10s。探测器的饱和值在nm，因此数据会显示在nm到nm范围之间。

2.5分子排阻色谱法

SEC是用来评估单体和高分子杂质含量以及质量损失情况的方法，实验仪器是一个DionexUltiMateHPLC系统(ThermoFisherScientific,Waltham,USA)。洗脱液50mM磷酸钠缓冲液含mMNaClph7.00.22um过滤后在nm检测高分子杂质信号，nM检测单体含量和质量损失信号。起初的抗体作为对照T0抗体，单体含量基于样品峰值处nm占所有峰面积的比例，高分子杂质是计算抗体主峰（nm）之前的峰和除以总峰和之前的峰和。浓度与T0关系是各样品在n峰处的单体与不同捕获方法的（ProA和沉淀）T0样品之间的比值。三次数据获得都平均值和标准差，所有样品的注射体积和样品稀释度保持不变。

2.6PH梯度色谱进行异构体的表征

抗体异构体的测定是用Lingg等人研究的PH梯度的阳离子交换HPLC法18。总之，尺寸的表征是在DionexUltiMateHPLCsystem(ThermoScientific)系统上样品稀释到1g/l注射体积是ul，流速设定为1ml/min，在进行12CV的0到梯度之前用1CV%A平衡，实验结束后用1CV%B洗涤，洗涤液A是5.5mMHEPES,4.2mM甘氨酸，9.5mMCAPSO0.8mMCAPSand6.3mMNaCl(pH8.0).缓冲液B是10.5mM甘氨酸2.5mMCAPSO,7.0mMCAPS(pH10.5)，对出口在nm处进行了监测，最主要的大量异构体被称做是主电荷变体（MCV），在主变体之前洗脱下来的是酸性异构体，之后的是碱性异构体。事实上，该方法最低限度和准确性是Ligget等人发现的19，所有样品的注射体积和稀释倍数都保持一样。

2.7纳米差示扫描荧光法

NANODSF是在NT.6上实验的(Nanotemper,Germany)，样品稀释在25mMph7.5浓度为1g/L的Tris再加入DSF的玻璃毛细管中，起始温度设定到35℃，上升速率设施到30℃/min,温度范围设置到35℃到95℃。

3结果

3.1单体的含量，高分子杂质和产品损失率

为了研究抗体中间体的稳定性，我们用ProA层析法和抗体混合浓度为13.2%的PEG沉淀法纯化细胞培养上清液，ProA层析法抗体洗脱液是PH3.6放置1h后调到Ph6.0，PEG沉淀法的样品以固体的形式储存在13.2%聚乙二醇中，为了模拟中间体不同的储存条件，样品都储存在三个不同温度下，符合常用的中间体储存条件-20℃和5℃，和常温包括可以快速降解的极端环境。所有样品总共储存13个月，为了避免反复冻融，ProA法纯化的抗体和沉淀法纯化抗体的多组试样都会单独命名实验分析后丢弃。

样品在开始和储存1、3、6、10、13个月以后用不同的方法测试单体含量、聚集体和损失，用CD、DSC、DSF测定蛋白结构变化。（图1）展示了样品捕获前后的组分。

细胞上清液中的高分子杂质和低分子杂质在ProA和沉淀法纯化被有效的去除了，如果要进一步的比较层析法和沉淀法可以看Sommee(14.20)和Hammerschmidt.15

图2是三个不同测试温度下两种纯化方法的单体的含量图，经过13个月的储存后ProA层析法纯化的样品在三个不同温度下的单体含量都下降了大约2%从99.8%到98%，这个也反应了高分子杂质的上升（图3）

Figure1:Sizeexclusionchromatogramoftheantibodiesbefore(CCCF)andaftercapturestep(eitherproteinA

chromatographyorprecipitation).Duetodifferentpurificationefficiencies,theamountofHMWIandLMWIarelowerintheproteinApurifiedpool